df-101s集热磁力搅拌器快速构建细胞微载体筛选培养系统

技术领域

[0001]本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种df-101s集热式磁力搅拌器快速构建细胞微载体筛选培养系统的方法，尤其是快速筛选微载体培养系统中与细胞相适合的微载体、培养基的方法。

背景技术

[0002]目前主要有两种基本的细胞培养体系，一种是使细胞在人工基质上单层生长，即贴壁培养；另一种是使细胞在培养基中自由漂浮生长，即悬浮培养。微载体培养是目前公认的最有发展前途的一种动物细胞大规模培养技术，微载体(microcarrier)是指直径在60-250um，能适用于贴壁细胞生长的微珠。微载体培养是以微小颗粒作为细胞贴附的载体，可提供相当大的贴附面积，由于载体体积很小，比重较轻，在轻度搅拌下即可使得细胞悬浮在培养液内，最终能够使细胞在载体表面繁殖成单层的一种细胞培养技术。微载体培养兼具

悬浮培养和贴壁培养的优点，放大容易。目前微载体培养广泛用于培养各种类型细胞。

[0003]在微载体培养细胞的过程中，细胞类型、微载体种类、培养基配方这三种的组合至关重要。因此在微载体培养细胞的前期，需要将目的细胞与不同微载体、培养基进行组合后进行培养，选择针对目的细胞合适的微载体种类与培养基。微载体～般是由天然葡聚糖、胶原或者聚苯乙烯等各种合成的聚合物组成。国际市场上出售的微载体商品的类型已经达十几种以上，包括液体微载体、大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。常用商品化微载体有三种：Cytodexl、2、3,Cytopore和Cytoline。
[0004]目前传统的方法是将细胞放置不同的25-50mL微载体培养瓶中，进行细胞一微载体一培养基的摸索，该方法需要耗费大量的微载体培养瓶以及占用培养箱空间，且超低贴附的培养板价格昂贵，需要耗费大批量的设备、仪器与耗材，成本较高。

发明内容

[0005]有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的问题，提供一种快速筛选细胞微载体培养系统的方法。本发明所述方法可以省用空间与仪器，进行大批量的微载体培养体系的筛选，获得微载体培养系统中与细胞相适合的微载体、培养基，且无需昂贵的耗材。

[0006]为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

[0007]一种快速筛选细胞微载体培养系统的方法，包括如下步骤：

[0008]A、不同的微载体与不同的培养基混合接种细胞，得到微载体一细胞混合的墙养基；

[0009]B、将微载体一细胞混合的培养基接种到琼脂糖铺板的培养板上，在细胞培养箱内静置3-12小时，然后以0-60rpm转速在细胞培养箱摇培，每日取样微载体，观察微载体上细胞贴壁增殖情况；每3天更换新鲜的培养基，培养细胞5-7天。

[0010]本发明所述快速筛选细胞微载体培养系统的方法利用琼脂糖溶液铺板培养板底部，冷却凝固可以使细胞不贴附底部，代替超低贴附的培养板。

[0011]作为优选，本发明所述的方法步骤B所述琼脂糖铺板具体为2%-500/的琼脂糖水溶液铺满培养板底部，冷却凝固。在一些实施方案中，所述琼脂糖水溶液的浓度为20A。在一些实施方案中，所述琼脂糖水溶液的浓度为50%。在一些实施方案中，所述琼脂糖水溶液的

浓度为10%。

[0012]本发明所述培养板可以为6-48孔板，如6、12、24、48孔板。利用琼脂糖水溶液对所述培养板进行预处理后进行微载体一培养基组合实验，可以快速验证细胞在某一种微载体一培养基组合上是否能够贴壁培养，以及在这种条件下进行初步的增殖。

[0013]本发明所述的方法步骤A所述微载体可以为目前市场上出售的任一种商品化的微载体，如Cytodexl、2、3，Cytopore、Cytoline、SolohillPlastic、SolohillHellex等。作为优选，本发明所述的方法步骤A所述微载体包括Cytodex-I、Cytodex-3、SolohillPlastic、SolohillHellex。

[0014]本发明所述的方法步骤A所述培养基可以为任一种用于培养人或动物来源贴壁型细胞培养的培养基。作为优选，本发明所述的方法步骤A所述培养基包括a-MEM+IO%FBS、DMEM+100/FBS、DMEM/F12+10/0FBS，StemPro@MSCSFMXeno-Free。

[0015]本发明所述的方法步骤A所述细胞可以为任意人或动物来源贴壁型细胞，如各种来源的间充质干细胞。作为优选，本发明所述的方法步骤A所述细胞为骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、牙髓间充质干细胞。在一些实施方案中，步骤A所述细胞为骨髓间充质干细胞；在一些实施方案中，步骤A所述细胞为脐带间充质干细胞；在一些实施方案中，步骤A所述细胞为脂肪间充质干细胞。

[0016]本发明所述方法步骤B中以0-60rpm转速在细胞培养箱摇培，Orpm摇培是指培养板一直处于静止状态培养。

[0017]作为优选，本发明所述的方法还包括统计培养后的细胞活力与细胞总数的步骤。

[0018]作为优选，所述统计培养后的细胞活力与细胞总数的步骤具体为收集微载体，胰酶消化微载体上的细胞，收集细胞沉淀，完全培养基重悬后，统计细胞活力与细胞总数。

[0019]作为优选，所述收集微载体具体为弃去培养上清，将微载体用PBS重悬后，转移至新的离心管中，用PBS清洗一次。

[0020]作为优选，所述胰酶消化微载体上的细胞具体为加入0.25%胰酶-EDTA，放置茌37。C恒温摇床孵育15-30分钟。

[0021]作为优选，所述收集细胞沉淀具体为将消化后的混合液过70um的细胞筛网，过滤掉微载体，滤液放置在新的离心管内，以1000-1500rpm离心5-10分钟，收集细胞沉淀。

[0022]由上述技术方案可知，本发明提供了一种快速筛选细胞微载体培养系统的方法，该方法为不同的微载体与不同的培养基混合接种细胞，得到微载体一细胞混合的培养基；将微载体一细胞混合的培养基接种到琼脂糖铺板的培养板上，在细胞培养箱内静置3-12小时，然后以0-60rpm转速在细胞培养箱摇培，每日取样微载体，观察微载体上细胞贴壁增殖情况；每3天更换新鲜的培养基，培养细胞5-7天。本发明利用琼脂糖溶液铺板培养板底部，利用琼脂糖溶液处理后的多孔培养板进行细胞微载体一培养基的快速筛选，可以完全替换微载体培养瓶与df-101s集热式磁力搅拌器的组合设备，进行大批量的微载体培养体系的筛选，达到验证细胞是否贴壁、增殖的目的，获得微载体培养系统中与细胞相适合的微载体、培养基，同时可以省用空间与仪器，且无需昂贵的耗材。

附图说明

[0023]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

[0024]图1示第1天培养微载体上细胞贴壁情况；

[0025]图2示第4天培养微载体上细胞贴壁情况。

具体实施方式

[0026]本发明公开了一种快速筛选细胞微载体培养系统的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过

较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0027]为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0028]如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

[0029]卖施例1：

[0030]配制2%的琼脂糖溶液：称量29琼脂糖粉末，搅拌加热溶解后，加入超纯水定容至lOOmL。将溶液放置70。C烘箱，防止凝固。在超净台内，将琼脂糖溶液倒入24孔培养板，铺满培养板底部。随后放置在4。C冰箱冷却凝固。将灭菌后的每一种微载体(GE公司的Cytodex-1、Cytodex-3，Pall公司的solohillPlastic、solohillHellex工工)与(a-MEM+IO%FBS；DMEM+IO%FBS；DMEM/F12+10%FBS；StemPro~MSCSFMXeno-Free)四种培养基分别混匀，共16组（表1），接种骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)P3代细胞，接种密度为5×104cells/mL。将微载体一细胞混合的培养基接种到琼脂糖铺板的培养板上，每孔1.OmL。吹打混匀后，静置在细胞培养箱内3小时，随后将微型摇床放置在培养箱内，再将以30rpm转动，每日取样微载体，观察微载体上细胞贴壁增殖情况；每3天换液，培养细胞5天。吸取培养上清，将微载体用PBS重悬后，转移至50mL的离心管中，用PBS清洗一次后，用0.250/胰酶-EDTA淌化微载体上的细胞，放置在37。C恒温摇床孵育15分钟；随后将混合液过70um的细胞筛网，过滤掉微载体，滤液放置在新的离心管内，以1500rpm离心5分钟，收集细胞沉淀；用完全培养基进行重悬，进行细胞活力与细胞总数的计算。

[0031]表1微载体一培养基组合编号

[0033]实施例2：

[0034]配制50%的琼脂糖溶液：称量509琼脂糖粉末，搅拌加热溶解后，加入超纯水定容至lOOmL。将溶液放置70。C烘箱，防止凝固。在超净台内，将琼脂糖溶液倒入12孔培养板，铺满培养板底部。随后放置在4。C冰箱冷却凝固。将灭菌后的每一种微载体(GE公司的Cytodex-I，Cytodex-3，Pall公司的solohillPlastic、solohillHellex工工)与(a-MEM+10%FBS;DMEM+IO%FBS;DMEM/F12+10%FBS;StemPro⑧MSCSFMXeno-Free)四种培养基分别混匀，共16组（表1），接种人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)P3代细胞，接种密度为5×104cells/mL。将微载体一细胞混合的培养基接种到琼脂糖铺板的培养板上，每孔1.5mL。静置在细胞培养箱内6小时，随后将微型摇床放置在培养箱内，再将以60rpm转动，每日取样微载体，观察微载体上细胞贴壁增殖情况；第3天换液；培养细胞5天。吸取培养上清，将微载体用PBS重悬后，转移至50mL的离心管中，用PBS清洗一次后，用0.250/胰酶-EDTA消优微载体上的细胞，放置在37。C恒温摇床孵育15分钟；随后将混合液过70um的细胞筛网，过滤掉微载体，滤液放置在新的离心管内，以1500rpm离心5分钟，收集细胞沉淀；用完全培养基进行重悬，进行细胞活力与细胞总数的计算。

[0035]实施例3：

[0036]配制10%的琼脂糖溶液：称量109琼脂糖粉末，搅拌加热溶解后，加入超纯水定容至lOOmL。将溶液放置70。C烘箱，防止凝固。在超净台内，将琼脂糖溶液倒入6孔培养板，铺满培养板底部。随后放置在4。C冰箱冷却凝固。将灭菌后的每一种微载体(GE公司的Cytodex-1，Cytodex-3，Pall公司的solohillPlastic、solohillHellex工工)与(a-MEM+IO%FBS；DMEM+IO%FBS;DMEM/F12+10%FBS;StemPro⑧MSCSFMXeno-Free)四种培养基分别混匀，共16组（表1），接种脂肪干细胞(ADSCs)，接种密度为5×104cells/mL。将微载体一细胞混合的培养基接种到琼脂糖铺板的培养板上，每孔2.OmL。吹打混匀后，静置在细胞培养箱内12小时，随后将微型摇床放置在培养箱内，再特以60rpm转动，每日取样微载体，观察微载体上细胞贴壁增殖情况；第3天换液；培养细胞5天。吸取培养上清，将微载体用PBS重悬后，转移至50mL的离心管中，用PBS清洗一次后，用0.250/胰酶-EDTA消化微载体上的细胞，放置在37。C恒温摇床孵育30分钟；随后将混合液过70um的细胞筛网，过滤掉微载体，滤液放置在新的离心管内，以1500rpm离心5分钟，收集细胞沉淀；用完全培养基进行重悬，进行细胞活力与细胞总数的计算。

[0037]对比例l

[0038]将灭菌后的每一种微载体(GE公司的Cytodex-I，Cytodex-3，Pall公司的solohillPlastic、solohillHellexII)与(a-MEM+IO%FBS;DMEM+IO%FBS;DMEM/F12+10%FBS;StemPro~MSCSFMXeno-Free)四种培养基分别混匀，共16组（表1），接种骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)P3代细胞，接种密度为5×104cells/mL。将微载体一细胞混合的培养基接种到超低贴附的24孔培养板上，每孔1.OmL。吹打混匀后，静置在细胞培养箱内3小时，随后将微型摇床放噩在培养箱内，再将以30rpm转动，每日取样微载体，观察微载体上细胞贴壁增殖情况；第3天换液；培养细胞5天。吸取培养上清，将微载体用PBS重悬后，转移至50mL的离心管中，用PBS清洗一次后，用0.250/胰酶-EDTA消化微载体上的细胞，放置在37。C恒温摇床孵育15分钟；随后将混合液过70um的细胞筛网，过滤掉微载体，滤液放置在新的离心管内，以1500rpm离心5分钟，收集细胞沉淀；用完全培养基进行重悬，进行细胞活力与细胞总数的计算。

[0039]对比例2-

[0040]将灭菌后的每一种微载体(GE公司的Cytodex-I，Cytodex-3，Pall公司的solohillPlastic、solohillHellexII)与(a-MEM+IO%FBS;DMEM+IO%FBS;DMEM/F12+10%FBS;StemPro⑧MSCSFMXeno-Free)四种培养基分别混匀，共16组，接种人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)P3代细胞，接种密度为5×104cells/mL。将微载体一细胞混合的培养基接种到超低贴附的12孔培养板上，每孔1.5mL。吹打混匀后，静置在细胞培养箱内6小时，随后将微型摇床放置在培养箱内，再将以60rpm转动，每日取样微载体，观察微载体上细胞贴壁增殖情况；第3天换液；培养细胞5天。吸取培养上清，将微载体用PBS重悬后，转移至50mL的离心管中，用PBS清洗一次后，用0.250/胰酶-EDTA消化微载体上的细胞，放置在37。C恒温摇床孵育15分钟；随后将混合液过70Um的细胞筛网，过滤掉微载体，滤液放置在新的离心管内，以1500rpm离心5分钟，收集细胞沉淀；用完全培养基进行重悬，进行细胞洁力与细胞总数的计算。

[0041]对比例3：

[0042]将灭菌后的每一种微载体(GE公司的Cytodex-I，Cytodex-3，Pall公司的solohillPlastic、solohillHellexII)与(a-MEM+IO%FBS;DMEM+IO%FBS;DMEM/F12+10%FBS;StemPro~MSCSFMXeno-Free)四种培养基分别混匀，共16组，接种脂肪干细胞(ADSCs)，接种密度为5×104cells/mL。将微载体一细胞混合的培养基接种到超低贴附的6孔培养板上，每孔2.OmL。吹打混匀后，静置在细胞培养箱内12小时，随后将微型摇床放置在培养箱内，再将以60rpm转动，每日取样微载体，观察微载体上细胞贴壁增殖情况；第3天换液；培养细胞5天。吸取培养上清，将微载体用PBS重悬后，转移至50mL的离心管中，用PBS清洗一次后，用0.25%胰酶-EDTA消化微载体上的细胞，放置在37。C恒温摇床孵育30分钟；随后将混合液过70llm的细胞筛网，过滤掉微载体，滤液放置在新的离心管内，以1500rpm离心5分钟，收集细胞沉淀；用完全培养基进行重悬，进行细胞活力与细胞息数的计算。

[0043]试验例l、细胞贴壁效果检测

[0044]取实施例1-3，对比例1-3的第1天、第4天培养的细胞一微载体0.ImL，静置后去除培养基，用PBS清洗后，加入lOuL的DAPI染料4。C孵育15分钟，清洗染料，加入PBS清洗后，放置在载玻片上，在荧光显微镜上观察微载体上细胞贴壁情况。镜下观察可见，各实施例与对应的对比例相比，细胞贴壁效果相当，均未出现细胞粘附于培养板底面，微载体小球均匀分布，偶见小聚团，细胞粘附于微载体表面，贴壁情况良好（见图1）。培养四天后各实施例细胞增殖效果明显，细胞形态正常（见图2）。说明采用本发明的方法，使用普通的培养板即可达到使用价格昂贵的低粘附培养板才有的效果，且不需要使用微载体培养瓶与df-101s集热式磁力搅拌器的组合设备，节省了空间与成本，操作简单，快速省时。

[0045]试验例2、细胞增殖效果及活率检测

[0046]按实施例1-3，对比例1-3的实验设计，细胞培养5天后，吸取培养上清，将微载体用PBS重悬后，转移至50mL的离心管中，用PBS清洗一次后，用0.250/胰酶-EDTA消化微载体上的细胞，放置在37。C恒温摇床孵育15分钟；随后将混合液过70um晌细胞筛网，过滤掉微载体，滤液放置在新的离心管内，以1500rpm离心5分钟，收集细胞沉淀；用完全培养基进行重悬，台盼蓝染色后，用细胞计数仪中计数细胞总量与活率。结果表明，各实施例与对应的对比例相比，细胞增殖活性无显著性差异，各实施例细胞活率均在90%以上，与各对比例无显著性差异。说明采用本发明的方法不影响细胞的增殖活性。