一种基于df-101s集热式恒温加热磁力搅拌器的锰氨氧化过程装置及其使用方法和应用

 

　　技术领域

 

　　[0001]本发明属于水处理工程技术领域，具体涉及一种一种基于df-101s集热式恒温加热磁力搅拌器的锰氨氧化过程装置及其使用方法和应用。

 

　　背景技术

 

　　[0002]随着经济和工农业的快速发展，中国已经成为世界最大的氮素排放国和生产国。大量氮肥的使用，使得农田生态系统成为氮污染的重灾区，沟道作为农业排水沟不可缺少的一部分更是承担了大部分的氮素积累。农田沟道过量的氮素经雨水的冲刷淋溶流入河流湖泊导致水体富营养化，严重污染自然水体，破坏生态平衡。最近的研究发现，锰氨氧化能在厌氧环境中利用金属氧化物二氧化锰为电子受体实现氮素的去除，这一现象广泛存在于海底沉积物、河口滩涂湿地以及森林土壤中，其中锰还原菌是其主要的脱氮微生物。对锰氨氧化在农田旁沟道土壤中的研究，有助于提升土壤的脱氮速率，减少氮污染，对河道湖泊富营养化的控制有很重要的理论和现实意义。

 

　　[0003]微生物过程的硝化反硝化和厌氧氨氧化过程一直以来都被认为是自然界中脱氮的主要途径。锰元素作为土壤中含量第二的含有多价态的重金属元素，锰氨氧化的发现无疑对土壤中重金属氧化物和氮素的循环有着里程碑式的意义；土壤氮素循环木再仅存在于单个元素间，而是多种元素的相互作用，是整个生态系统各种元素之间的不可忽视的循环。锰氨氧化是指微生物在厌氧条件下，利用二氧化锰为电子受体氧化NH4+，生成N02-，N03-和N2的过程。

 

　　[0004]目前对于土壤反硝化和厌氧氨氧化的研究已经比较成熟。通过构建一个密闭的反应器，根据密闭系统气体状态方程式计算并测量相关数据，可以实时原位测量土壤硝化反硝化的速率。专利申请号为CN201610116208.9的中国专利公开了一种土壤呼吸、硝化、反硝化过程速率原位测量方法，通过一种模拟装置，对河道底泥厌氧氨氧化过程有直观的了解并探究物理、化学、生物等因素对河道底泥厌氧氨氧化过程的影响；专利申请号为CN201410633441.5的中国专利公开了一种模拟原位河道底泥厌氧氨氧化过程的装置和使用方法及应用，而有关锰氨氧化的研究较少，基本上处于理论探究阶段。

 

　　[0005]GeorgeW.Luther等人(GeochimicaetCosmochimicaActa,1997,Interactionsofmanganesewiththenitrogencycle:alternativepathwaystodnitrogen)遁过里予外和室内培养实验以及热力学公式计算，提出了海洋底泥中锰氨氧化的存在，并指出硝酸盐、亚硝酸盐和氮气为直接产物；CedricJavanaud等(ResearchinMicrobiology，2011，AnaerobicammonlumoxidationmediatedbyMn-oxides:fromsedimenttostrainlevel)证明了阿卡雄湾底泥中锰氨氧化的存在，通过同位素示踪技术检测到了29N2的产生，并研究了主要的锰还原微生物arinobacterdaepoensis和Shewanella，其中脱氮速率占总氮去除的3-8%；SenQiao等(BioresourceTechnology，2012，LongtermeffectofMn02powderadditiononnitrogenremovalbyanammoxprocess)发现二氧化锰台邑有效提升厌氧氨氧化污泥的活性，氨氮负荷率和总氮去除率能达到未添加二氧化锰反应器的2倍。

 

　　[0006]然而，由于沟道土壤本身含有较多的铁元素，而目前已有报道三价铁离子亦可作为电子受体参与厌氧氨氧化，生成硝酸盐、亚硝酸盐和氮气，因此铁元素的存在会干扰锰氨氧化的测定(NatureGeoscience，2012，NitrogenLossfromSoilthroughAnaerobicAmmoniumOxidationCoupledtoIronReduction)。培养铁氨氧类微生物的培养基包括NH4CI50mg/L,NaHC03600mg/L,MgC12·6H2016.5mg/L,KH2P0427mg/L,CaCI·2H2092mg/L，以及微生物生长所需的痕量元素溶液和维他命溶液，溶液pH控制在6.5左右(EnvironmentalScience&Technology,2016,ElectronshuttlesenhanceanaerobicammonlumoxidationcoupledtoIron(III)reduction)。然而，有关锰氨氧类微生物的培养条件及环境因素仍然尚待研究。

 

　　[0007]刭目前为止，如何在室内通过模拟农业排水沟环境，并探究农田沟道土壤中的锰氨氧化过程的模拟技术方法还未见报道。采用人工模拟沟道原位环境，进行包括水温、光照强度、溶解氧、电子受体以及水质参数等综合调控及优化，来研究农田沟道中锰氨氧化过程的装置尚未有开发。因此，研究此类技术和装置对氮素的脱除及农田沟道氮污染控制具有重要意义。

 

　　发明内容

 

　　[0008]本发明需要解决的技术问题：一是确认农田沟道中锰氨氧化的发生；二是探索锰氨氧化对农田等环境中氮素的迁移转化的影响。本发明提供了一种模拟农田沟道土壤的锰氨氧化过程的装置，方便对锰氨氧化速率(采用同位素方法测定29N2，30N2以区分硝化反硝化产生的N2与锰氨氧化产生的N2)，锰还原菌丰度及微生物群落结构的测定，使用该装置对于研究农田沟道中氮素迁移转化的过程可以提供理论基础和实际意义。

 

　　[0009]本发明是通过以下技术方案实现的：

 

　　[0010]一种模拟农田沟道土壤的锰氨氧化过程装置，所述装置包括圆柱形的透明柱身、设于柱身上部的卤素灯、设于柱身底部的df-101s集热式恒温加热磁力搅拌器、设于柱身一侧的蓄水池以及计算机主机；所述柱身上方设置有与柱身顶部匹配的透明密封盖，柱身内底部填充有衣田沟道土壤和微生物凝胶载体，柱身外填装土壤的位置包裹有锡箔纸，保证内部土壤处于遮光环境中；所述柱身顶部通过进水管与蓄水池相连，进水管上连接有蠕动泵和进水阀；所述柱身底部侧壁上设有采取水样用的采样口，采样口口部设有控制开关的出水阀；所述柱身内还设有有溶解氧探头和pH探头，两者分别与计算机主机连接，用于对柱身中水体的pH和溶解氧程度实时在线检测，柱身内底部设有磁力转子，用于轻微搅拌柱身中的微生物使其保持均匀生长。

 

　　[0011]本发明进一步解决的技术方案是，所述微生物凝胶载体是由2-羟乙基甲基丙烯酸酯与丙烯酸一2一羟乙酯按照摩尔比4：1进行辐照制备。

 

　　[0012]本发明进一步解决的技术方案是，所述圆柱形的透明柱身高30cm，直径为20cm。

 

　　[0013]本发明还保护一种模拟农田沟道土壤的锰氨氧化过程装置的使用方法，包括如下

 

　　步骤：

 

　　[0014]步骤一、配制微生物培养基溶液：所述微生物培养基溶液包括基础培养液、维生素母液和微量元素母液；在每IL基础培养液中分别加入ImL维生素母液和ImL微量元素母液，配制形成微生物培养基溶液；

 

　　[0015]步骤二、微生物培养基溶液预处理：将步骤一配制的微生物培养基溶液置入蓄水池，然后通入高纯氦气，通气30分钟并同时监测其溶解氧浓度，直到溶解氧低于0.5mg/L时停止通气；

 

　　[0016]步骤三、铁离子去除过程：将采泥器采集的农田沟道土壤与微生物凝胶载体均匀混合后装入到圆柱形柱身中，填装高度为15-25cm，同时加入二氧化锰，盖上密封盖并在柱身外部包裹锡箔纸；打开进水阀将步骤二预处理后的微生物培养基溶液通过蠕动泵缓慢注入柱身直至充满整个柱身；每5天更换溶液，更换时重新添加二氧化锰，由此循环操作实验直至采样口出液澄清透明，柱身中无土壤残留；

 

　　[0017]步骤四、锰氨氧化过程：放除柱身中步骤三处理完成后的溶液，重新打开进水阀进行微生物培养基溶液的填充，同时加入二氧化锰以及15NH4CI同位素，盖上密封盖以形成厌氧环境；每5天更换溶液，更换时重新添加二氧化锰与15NH4CI同位素，由此循环操作；

 

　　[0018]步骤五、观察与分析：每隔24h由采样口采集装置内的水样，检测模拟装置水样申的30N2，29N2的排放通量以确定锰氨氧化的脱氮量以及硝化反硝化的脱氮量，以及水体中的总氮与锰离子浓度，从而分析确认锰氨氮氧化过程的存在以及环境因子与锰氨氧化之间的关系。

 

　　[0019]其中，调控的环境因子为营养盐浓度、光照强度、pH或温度；营养盐浓度通过向进水中添加相应的盐实现；光照强度采用卤素灯光源进行照射，通过光强计来进行测量；温度通过df-101s集热式恒温加热磁力搅拌器的温度控制器进行辅助温度的调节和控制，控制整个柱体在实验过程中的温度保持在10-40。C的范围内。

 

　　[0020]进一步地，所述步骤一中的基础培养液的具体配置为：每IL去离子水中添加0.05gNH4CI、0.6gNaHC03、0.0165gMgC12·6H20、0.027gKH2P04以及0.092gCaC12·2H20.

 

　　[0021]进一步地，所述步骤一中的维生素母液的具体配置为：每IL去离子水中添加O.lg核黄素、O.lg硫胺素、O.lg生物素、O.lg尼克酸、O.lg吡哆素以及O.lg叶酸。

 

　　[0022]进一步地，所述步骤一中的微量元素母液的具体配置为：每IL去离子水中添加1.5gH3803、0.8gMr-1S04·7H20、O.lgCuS04．7H20、0.2g(NH4)6M07024·4H20、O.OlgCoC12以及0.6gZr-1S04。

 

　　[0023]进一步地，所述步骤三中，填装农田沟道土壤与微生物凝胶载体的质量比为2：1。

 

　　[0024]进一步地，所述步骤三中，每填装20cm高度的农田沟道土壤与微生物凝胶载体时，需要加入6mg_氧化锰。

 

　　[0025]本发明还提供了上述模拟农田沟道土壤的锰氨氧化过程装置的使用方法在富营养化河道湖泊水体治理中的应用。

 

　　[0026]本发明的有益效果为：

 

　　[0027]1．本发明所述的装置设计合理，巧妙利用微生物凝胶载体负载了原位土壤微生物，在微生物条件下，合理地模拟农田沟道土壤锰氨氧化的过程，方便对锰氨氧化速率进行测定，可以确认环境中的锰氨氧化过程。

 

　　[0028]2．装置结构简单，成本低，易操作，制作方便，功能多样，可以方便地进行不同环境因子对锰氨氧化过程的影响的研究。

 

　　附图说明

 

　　[0029]图1为本发明所述装置结构示意图。

 

　　[0030]图2为实施例3小试实验中的水体氨氮浓度随时间的变化图。

 

　　[0031]图3为实施例3小试实验中的水体硝态氮浓度随时间的变化图。

 

　　[0032]图4为实施例3小试实验中的水体亚硝态氮浓度随时间的变化图。

 

　　[0033]图5为实施例4小试实验中的水体总氮去除率随时间的变化图。

 

　　[0034]图6为实施例5小试实验中的水体锰离子浓度随时间的变化图。

 

　　[0035]图7为实施例6小试实验中的水体溶解的30N2随时间的变化图。

 

　　[0036]图8为实施例6小试实验中的水体溶解的29N2随时间的变化图。

 

　　[0037]图9为实施例7农田沟道不同样点土壤中锰还原速率的比较图。

 

　　[0038]图10为实施例7农田沟道不同样点土壤中锰氨氧化速率的比较变化图。

 

　　[0039]图11为实施例8农田沟道不同样点土壤中锰还原菌的拷贝数。

 

　　[0040]图12为实施例8农田沟道不同样点土壤中微生物群落结构示意图。

 

　　[0041]图中序号，卜柱身、2一卤素灯、3-df-101s集热式恒温加热磁力搅拌器、4-蓄水池、5-计算机主机、6-密封盖、7-进水管、8-蠕动泵、9-进水阀、10-采样口、II-出水阀、12-溶解氧探头，13-pH探头、14-磁力转子。

 

　　具体实施方式

 

　　[0042]为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例和附图对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。

 

　　[0043]实验所用土壤来自无锡太湖贡湖九里河流域农田沟道。采集农田沟道土壤完成后，避光保存，在2h内送回实验室，转移到本装置中，完成整个实验室室内模拟环境的构造。

 

　　[0044]实施例1

 

　　[0045]一种模拟农田沟道土壤的锰氨氧化过程装置，所述装置包括圆柱形的透明柱身1、所述圆柱形的透明柱身1高30cm，直径为20cm，设于柱身1上部的卤素灯2、设于柱身1底部的df-101s集热式恒温加热磁力搅拌器3、设于柱身1-侧的蓄水池4以及计算机主机5；所述柱身l上方设置有与柱身项部匹配的透明密封盖6，柱身1内底部填充有农田沟道土壤和微生物凝胶载体，柱身1外填装土壤的位置包裹有锡箔纸，保证内部土壤处于遮光环境中；所述柱身1顶部通过进水管7与蓄水池4相连，进水管7上连接有蠕动泵8和进水阀9；所述柱身1底部侧壁上设有采取水样用的采样口10，采样口10口部设有控制开关的出水阀II;所述柱身1内还设有有溶解氧探头12和pH探头13，两者分别与计算机主机5迮接，用于对柱身1中水体的pH和溶解氧程度实时在线检测，柱身l内底部设有磁力转子14，用于轻微搅拌柱身中的微生物使其保持均匀生长。

 

　　[0046]其中，所述卤素灯2用于提供光源对整个装置进行照射，控制装置中的光照强度；所述df-101s集热式恒温加热磁力搅拌器3用于轻微搅拌微生物絮体，促进微生物均匀生长，同时df-101s集热式恒温加热磁力搅拌器具备温度控制器可以进行辅助温度的调节和控制，实验中控制整个柱身在实验过程中的温度保持在10-40。C的范围内；所述蓄水池4用于盛装微生物培养基溶液，并通过通入氦气使上述溶液达到厌氧状态，并由蠕动泵8通过进水阀9进入柱身1内，有利于农田沟道土壤中微生物的培养；所述计算机主机5用于记录柱身1内部溶液的pH值与溶解氧值，有利于控制整个实验的环境与农田的实际环境一致。

 

　　[0047]实施例2

 

　　[0048]实验原料制备

 

　　[0049]微生物凝胶载体的制备：取摩尔比为4：1的2一羟乙基甲基丙烯酸酯与丙烯酸一2一羟乙酯置于水中制成混合溶液，其中水的体积占60%；然后将上述溶液置于60CoY-射线中在-78。C下照射lOh形成凝胶载体；所述微生物凝胶载体为吸水后的湿凝胶。

 

　　[0050]基础培养液的配置：取IL去离子水，添加0.05gNH4CI、0.6gNaHC03、0.0165gMgC12．6H20、0.027gKH2P04以及0.092gCaC12·2H20，搅拌后静置得到基础培养液备用。

 

　　[0051]维生素母液的配置：取IL去离子水，添加O.lg核黄素、0.lg硫胺素、0.lg生物素、O.lg尼克酸、O.lg吡哆素以及0.lg叶酸，搅拌后静置得到维生素母液备用。

 

　　[0052]微量元素母液的配置：取IL去离子水，添加1.5gH3803、0.8gMnS04·7H20、0.lgCuS04·7H20、0.2g(NH4)6M07024·4H20、O.OlgCoC12以及0.6gZriS04，搅拌后静置得到微量元素母液备用。

 

　　[0053]实施例3

 

　　[0054]小试实验（考察模拟实验裴置中水体中的氨氮、硝态氮、亚硝态氮浓度随时间的变化）。

 

　　[0055]实验方法步骤：

 

　　[0056]步骤一、取IL实施例2中配制的基础培养液，分别加入ImL维生素母液和ImL微量元素母液，配制形成微生物培养基溶液；

 

　　[0057]步骤二、将步骤一配制的微生物培养基溶液置入蓄水池，然后通入纯度为99.990/的高纯氦气，通气30分钟并同时监测溶液中的溶解氧浓度，控制溶解氧低于0.5mg/L后停止通气；

 

　　[0058]步骤三、在2小时内，将采泥器采集的509农田沟道土壤与实施例2制备的259微生物凝胶载体均匀混合后装入到圆柱形柱身中，填装高度为20cm，同时加入6mg_氧化锰，盖上密封盖并在柱身外部包裹锡箔纸；打开进水阀将步骤二预处理后的微生物培养基溶液通过蠕动泵缓慢注入柱身直至充满整个柱身；每5天更换溶液，更换时重新添加6mg_氧化锰，由此循环操作实验直至采样口出液澄清透明，柱身中无土壤残留，此时可以判定装置达到了反应过程中无铁离子干扰的要求；

 

　　[0059]步骤四、将步骤三处理完成后的溶液全部放除，重新打开进水阀进行微生物培养基溶液的填充至溶液充满整个柱身，同时加入6mg_氧化锰，盖上密封盖以形成厌氧环坑；每5天更换溶液，更换时重新添加6mg_氧化锰，由此循环操作，此时由于微生物附着生长于凝胶载体，轻微的环境扰动并不会造成微生物的脱落；

 

　　[0060]步骤五、每隔24h由水样取样口采集装置内的水样，分析氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮浓度随时间的变化，以确认无机氮去除过程是否存在。

 

　　[0061]经测定如图2、图3和图4所示，氨氮浓度、硝酸盐氮浓度和亚硝酸盐氮浓度随时间逐渐下降；氨氮浓度最高为50mg/L，最低为30mg/L;硝酸盐浓度最高为8.18mg/L，最低为4.32mg/L；亚硝酸盐浓度最高为1.06mg/L，最低为0.22mg/L。

 

　　[0062]实施例4

 

　　[0063]小试实验（考察模拟实验装置中水体中的总氮去除率随时间的变化）。

 

　　[0064]实验方法步骤：

 

　　[0065]步骤一、取IL实施例2中配制的基础培养液，分别加入ImL维生素母液和ImL微量元素母液，配制形成微生物培养基溶液；

 

　　[0066]步骤二、将步骤一配制的微生物培养基溶液置入蓄水池，然后通入纯度为99.990/的高纯氦气，通气30分钟并同时监测溶液中的溶解氧浓度，控制溶解氧低于0.5mg/L后停止通气；

 

　　[0067]步骤三、在2小时内，将采泥器采集的509农田沟道土壤与实施例2制备的259微生物凝胶载体均匀混合后装入到圆柱形柱身中，填装高度为20cm，同时加入6mg_氧化锰，盖上密封盖并在柱身外部包裹锡箔纸；打开进水阀将步骤二预处理后的微生物培养基溶液通过蠕动泵缓慢注入柱身直至充满整个柱身；每5天更换溶液，更换时重新添加6mg_氧化锰，由此循环操作实验直至采样口出液澄清透明，柱身中无土壤残留，此时可以判定装置达到了反应过程中无铁离子干扰的要求；

 

　　[0068]步骤四、将步骤三处理完成后的溶液全部放除，重新打开进水阀进行微生物培养基溶液的填充至溶液充满整个柱身，同时加入6mg_氧化锰，盖上密封盖以形成厌氧环境；每5天更换溶液，更换时重新添加6mg_氯化锰，由此循环操作，此时由于微生物附着生长于凝胶载体，轻微的环境扰动并不会造成微生物的脱落；

 

　　[0069]步骤五、每隔24h由水样取样口采集装置内的水样，分析总氮浓度随时间的变化，以确认总氮去除率。

 

　　[0070]经测定结果如图5所示，总氮去除率随时间逐渐上升，去除率最高为20.16%，最低为11.37%。

 

　　[0071]实施例5

 

　　[0072]小试实验（考察模拟实验装置中水体中锰离子浓度随时间的变化）。

 

　　[0073]实验方法步骤：

 

　　[0074]步骤一、取IL实施例2中配制的基础培养液，分别加入ImL维生素母液和ImL微量元素母液，配制形成微生物培养基溶液；

 

　　[0075]步骤二、将步骤一配制的微生物培养基溶液置入蓄水池，然后通入纯度为99.99%的高纯氦气，通气30分钟并同时监测溶液中的溶解氧浓度，控制溶解氧低于0.5mg/L后停止通气；

 

　　[0076]步骤三、在2小时内，将采泥器采集的509农田沟道土壤与实施例2制备的259微生物凝胶载体均匀混合后装入到圆柱形柱身中，填装高度为20cm，同时加入6mg_氧化锰，盖上密封盖并在柱身外部包裹锡箔纸；打开进水阀将步骤二预处理后的微生物培养基溶液通过蠕动泵缓慢注入桂身直至充满整个柱身；每5天更换溶液，更换时重新添加6mg_氧化锰，由此循环操作实验直至采样口出液澄清透明，柱身中无土壤残留，此时可以判定装置达到了反应过程中无铁离子干扰的要求；

 

　　[0077]步骤四、将步骤三处理完成后的溶液全部放除，重新打开进水阀进行微生物培养基溶液的填充至溶液充满整个柱身，同时加入6mg_氧化锰和lOOmg同位素15NH4CI，使得柱体外层中15N的浓度为lOOumolL-1，盖上密封盖以形成厌氧环境；每5天更换溶液，更换时重新添加6mg_氧化锰和lOOmg同位素15NH4CI，由此循环操作，此时由于微生物附着生长于凝胶载体，轻微的环境扰动并不会造成微生物的脱落；

 

　　[0078]步骤五、每隔24h由水样取样口采集装置内的水样，分析锰离子浓度随时间的变化。

 

　　[0079]对照组：

 

　　[0080]实验方法步骤与实施例5相同，不同的是在步骤四中不添加同位素15NH4CI。

 

　　[0081]经测定如图6所示，添加同位素15NH4CI的锰离子浓度随时间逐渐上升，而对照组中添加去离子水的锰离子浓度随时间增加缓慢。

 

　　[0082]实施例6

 

　　[0083]小试实验（考察模拟实验装置中水体中30N2和29N2排放通量随时间的变化）。

 

　　[0084]实验方法步骤：

 

　　[0085]步骤一、取IL实施例2中配制的基础培养液，分别加入ImL维生素母液和ImL微量元素母液，配制形成微生物培养基溶液；

 

　　[0086]步骤二、将步骤一配制的微生物培养基溶液置入蓄水池，然后通入纯度为99.990/的高纯氦气，通气30分钟并同时监测溶液中的溶解氧浓度，控制溶解氧低于0.5mg/L后停止通气；

 

　　[0087]步骤三、在2小时内，将采泥器采集的509农田沟道土壤与实施例2制备的259微生物凝胶载体均匀混合后装入到圆柱形柱身中，填装高度为20cm，同时加入6mg_氧化锰，盖上密封盖并在柱身外部包裹锡箔纸；打开进水阀将步骤二预处理后的微生物培养基溶液通过蠕动泵缓慢注入柱身直至充满整个柱身；每5天更换溶液，更换耐重新添加6mg_氧化锰，由此循环操作实验直至采样口出液澄清透明，柱身中无土壤残留，此时可以判定装置达到了反应过程中无铁离子干扰的要求；

 

　　[0088]步骤四、将步骤三处理完成后的溶液全部放除，重新打开进水阀进行微生物培养基溶液的填充至溶液充满整个柱身，同时加入6mg_氧化锰和lOOmg同位素15NH4CI，使得柱体外层中15N的浓度为lOOumolL-1，盖上密封盖以形成厌氧环境；每5天更换溶液，更换时重新添加6mg_氧化锰和lOOmg同位素15NH4CI，由此循环操作，此时由于微生物附着生长于凝胶载体，轻微的环境扰动并不会造成微生物的脱落；

 

　　[0089]步骤五、每隔24h由水样取样口采集装置内的水样，分析30N2和29N2排放通量随时间的变化以确定锰氨氧化的脱氮量以及硝化反硝化的脱氮量。

 

　　[0090]对照组：

 

　　[0091]实验方法步骤与实施例6相同，不同的是在步骤四中不添加同位素15NH4CI。

 

　　[0092]经测定如图7、图8所示，对照组并没有检测到30N2和29N2的产生，添加同位素15NH4CI的实验中30N2和29N2的浓度随时间逐渐增加。

 

　　[0093]实施例7

 

　　[0094]小试实验（考察不间采样点中锰氨氧化速率）。

 

　　[0095]实验方法步骤：

 

　　[0096]步骤一、取IL实施例2中配制的基础培养液，分别加入ImL维生素母液和ImL微量元素母液，配制形成微生物培养基溶液；

 

　　[0097]步骤二、将步骤一配制的微生物培养基溶液置入蓄水池，然后通入纯度为99.99%的高纯氦气，通气30分钟并同时监测溶液中的溶解氧浓度，控制溶解氧低于0.5mg/L后停止通气；

 

　　[0098]步骤三、在2小时内，将采泥器采集的农田沟道不同样点的509土壤（命名为A、B、C、D，分具体为120051'N，31058'E处表层0-5cm、5-lOcm、10-15cm、15-20cm不同深度层的土壤）与实施例2制备的259微生物凝胶载体均匀混合后装入到圆柱形柱身中，填装高度为20cm，同时加入6mg_氧化锰，盖上密封盖并在柱身外部包裹锡箔纸；打开进水阀将步骤二预处理后的微生物培养基溶液通过蠕动泵缓慢注入柱身直至充满整个柱身；每5天更换溶液，更换时重新添加6mg_氧化锰，由此循环操作实验直至采样口出液澄清透明，柱身中无土壤残留，此时可以判定装置达到了反应过程中无铁离子干扰的要求；

 

　　[0099]步骤四、将步骤三处理完成后的溶液全部放除，重新打开进水阀进行微生物培养基溶液的填充至溶液充满整个柱身，同时加入6mg_氧化锰和lOOmg同位素15NH4CI，使得柱体外层中15N的浓度为lOOumolL-1，盖上密封盖以形成厌氧环境；每5天更换溶液，更换时重新添加6mg_氧化锰和lOOmg同位素15NH4CI，由此循环操作，此时由于微生物附着生长于凝胶载体，轻微的环境扰动并不会造成微生物的脱落；

 

　　[0100]步骤五、每隔24h由水样取样口采集装置内的水样，用膜接口质谱仪分析水祥锰氨氧化的速率随时间的变化以确定锰氨氧化脱氮量；同时测定水样中锰离子浓度随时间的变化。

 

　　[0101]对照组：

 

　　[0102]实验方法步骤与实施例7相同，不同的是在步骤四中不添加同位素15NH4CI。

 

　　[0103]图9为加同位素15NH4CI对比不加同位素15NH4CI的农田沟道不同样点土壤(A、B、C、D)中锰还原速率变化关系图，由图9可知，加同位素15NH4CI的锰还原速率远高于不加同位素15NH4CI的锰还原速率，其中锰还原速率最高是D样点，为34.33mgMnkg-1d-1。

 

　　[0104]图10为加同位素l5NH4CI的农田沟道不同样点土壤(A、B、C、D)中锰氨氧化速率变化图，有图10可知，锰氨氧化的速率最高也为D样点，为0.85mgNkg。1d。1；最低为A样点，为0.39mgNkg-ld-1。

 

　　[0105]实施例8

 

　　[0106]小试实验（考察不同采样点中微生物群落组成）。

 

　　[0107]步骤一、取IL实施例2中配制的基础培养液，分别加入ImL维生素母液和ImL微量元素母液，配制形成微生物培养基溶液；

 

　　[0108]步骤二、将步骤一配制的微生物培养基溶液置入蓄水池，然后通入纯度为99.990/的商纯氦气，通气30分钟并同时监测溶液中的溶解氧浓度，控制溶解氧低于0.5mg/L后停止通气；

 

　　[0109]步骤三、在2小时内，将采泥器采集的农田沟道不同样点的509土壤（命名为A、B、C、D，具体为120051'N，31058'E处表层0-5cm、5-lOcm、10-15cm、15-20cm不同深度层的土壤）与实施例2制备的259微生物凝胶载体均匀混合后装入到圆柱形柱身中，填装高度为20cm，同时加入6mg_氧化锰，盖上密封盖并在柱身外部包裹锡箔纸；打开进水阀将步骤二预处理后的微生物培养基溶液通过蠕动泵缓慢注入柱身直至充满整个柱身；每5天更换溶液，更换时重新添加6mg_氧化锰，由此循环操作实验直至采样口出液澄清透明，柱身中无土壤残留，此时可以判定装置达到了反应过程中无铁离子干扰的要求；

 

　　[0110]步骤四、通过采集水样和微生物样品，分析农田沟道不同样点土壤中微生物群落组成。

 

　　[0111]微生物群落组成采用Miseq方法测定：前引物采用515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’），后引物采用907R（5’-CGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’）。

 

　　[0112]经测定，如图II和12所示，农田沟道不同样点土壤(A、B、C、D)中微生物群落组成如变形菌门(Proteobacteria)是细菌中最大的一个门，而锰还原菌主要分布在变形菌门，可以间接反映锰还原菌的丰度。

 

       [0113]以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。